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分光光度法的弹性分解活性

用分光光度法测定弹性分解活性的程序

下面以200-400目Elastin-Rhodamine为例. 其他基板也可以同样使用. 每种底物经弹性蛋白酶增溶后具有不同的吸收能力. 染色弹性蛋白可溶性多肽的吸光度;

Elastin-Rhodamine, 550海里
Elastin-Fluorescein, 495海里
Elastin-Orcein, 570海里
弹性刚果红,485纳米
Elastin-Remazol, 595海里

手术过程紧跟已公布的方法(9,10,11,35,36).

步骤1. 弹性蛋白酶可完全溶解已知数量的底物. 测定每毫克基质的光密度.

步骤2. 已知数量的弹性蛋白酶与底物孵育. 每毫克弹性蛋白酶可溶解的底物量(i.e.,比活度)是确定的. 未知物质的弹性分解活性可以与弹性酶的活性相比较来确定.

所需的材料

1. 底物 Suspension; 20mg/ml in 0.2 M Tris-HCl pH 8.8.
2. 缓冲; 0.2 M Tris pH 8.8.
3. 弹性蛋白酶; 2X crystallized or chromatographically purified.
4. 锥形烧瓶,10-25毫升大小或试管.
5. Dubnoff type incubator; equilibrated at 37°C.
6. 电磁搅拌器.
7. 冰浴.
8. 滤纸,Whatman No 41或同等的.

步骤1. 增溶衬底光密度的测定

检查下列方案和吸管缓冲液,然后将弹性酶放入10ml的烧瓶中. 通过磁力搅拌保持底物悬浮,用1将等分的水加入烧瓶中.0毫升吹吸管. NOTE> The elastase aliquot should contain 20-30 units activity. 这是多余的量,必须在30-60分钟内完全溶解底物.
 

          观察到的 O.D. 每毫克
缓冲 弹性蛋白酶 底物   O.D. 衬底(计算)
(No.) (ml) (ml) (ml) (mg) -------- --------
1(空白) 2.90 0.10 0 0 -------- --------
2 2.65 0.10 0.25 5.0 -------- --------
3 2.40 0.10 0.50 10.0 -------- --------
4 2.15 0.10 0.75 15.0 -------- --------
5 1.90 0.10 1.00 20.0 -------- --------


关闭烧瓶,37°孵育,每分钟40-60次,直到所有底物溶解(30 -60分钟)。. 用缓冲液将音量调到10ml,然后读取O.D. 在10毫米的试管中对准空白. 必须准备二次稀释,以便所有读数都在分光光度计的范围内. 记录每一个啊.D. 每毫克(乘以稀释因子),并计算O.D. 每毫克底物. O.D. 每毫克应接近恒定(±5%). O的图.D. 相对于底物的mg应该是一条直线.

步骤2. 单位弹性分解活性的测定

检查下列方案,然后将吸管缓冲液、弹性酶、底物放入10ml的烧瓶中. 输送等分液时,保持底物悬浮. 弹性蛋白酶的浓度应为0.2毫克/毫升缓冲液. 
消光系数:Î, 1%, 280 nm = 19.5 A280x 0.51 = mg / ml

          观察到的 O.D. 每毫克
缓冲 弹性蛋白酶 底物   O.D. 衬底(计算)
(No.) (ml) (ml) (ml) (mg) 0 0
1(空白) 2.0 0 0 1.0 -------- --------
2 1.9 0.1 0.02 1.0 -------- --------
3 1.8 0.2 0.04 1.0 -------- --------
4 1.7 0.3 0.06 1.0 -------- --------
5 1.6 0.4 0.08 1.0 -------- --------
6 1.5 0.5 0.10 1.0 -------- --------


盖上烧瓶,在37°C振荡孵育20分钟. 将烧瓶浸泡在冰中,用冷缓冲液使体积达到10毫升. 快速过滤No. 41 .把纸装入试管,读O.D. 滤液对空白的作用. 记录观察到的啊.D. 将观察到的O除以,计算出增溶底物的mg.D. 常数O.D. 每毫克,之前在步骤1中确定.

观察到的啊.D.

单位 = mg衬底可溶性 = O.D./ mg衬底
毫克                    mg弹性蛋白酶                      mg弹性蛋白酶

计算每毫克弹性酶可增溶的底物毫克数. 这个最后的计算给出了具体的活动. 特定弹性水解活性最广泛使用的单位定义是:在pH值8的条件下,一个单位可以在20分钟内溶解1mg弹性蛋白.8 - 37°C.

在上述程序中,用未知物质的等分来代替弹性酶,就可以确定未知物质的弹性水解活性. The relative amounts of buffer and unknown can be varied; however, 孵育箱的最终体积(3ml), pH值(8.8)和摩尔浓度(0.2 M Tris)必须是恒定的.

用荧光测定法测定弹性体的活性

同样的程序(上面)用于测定增溶底物的荧光强度和单位弹性分解活性. 弹性素荧光素或弹性素罗丹明都是合适的底物. 通常滤液必须用缓冲液稀释,以使荧光强度读数在荧光计的读出能力范围内.

当使用弹性素荧光素作为底物时,读取荧光强度,激发波长和发射波长分别设置为490nm和520nm, 分别. 使用弹性蛋白罗丹明时,激发波长为550nm,发射波长为570 nm.

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